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本制品是一种通过探针法qPCR快速、有效、高灵敏地定量检测各种生物制品样品中E.coli宿主细胞残留基因组DNA含量的试剂盒。本制品为防污染型，含有优化比例的高品质UDG酶和dUTP，可有效消除PCR扩增过程中带来的产物污染问题造成的假阳性或CT值偏低。

本试剂盒提供了qPCR实验所需的预混液2×ByFast Probe qPCR Mix (含UDG)和特异性引物探针混合物。预混液包含了高质量、无E.coli DNA残留的ByFast Taq DNA Polymerase、UDG酶、PCR Buffer、dNTPs、dUTP、稳定剂和镁离子等所有的通用组分；高纯度引物探针混合物以E.coli 23S rDNA的保守区序列作为靶点所设计，二者结合可用于E.coli DNA的超高灵敏度定量检测。此外，本试剂盒提供E.coli DNA Control，作为阳性对照，用于检测试剂盒本身是否能正常工作及构建标准曲线。

大肠杆菌(E.coli)常用于大规模表达和生产目标蛋白或生物活性分子，包括重组蛋白、疫苗以及抗癌药物等新型医用生物制品。这些生物制品在生产过程中，会有少量大肠杆菌细胞DNA片段的残留。这些片段可能具有免疫原性、感染性或者致瘤性，当其残留水平过高时就可能引发免疫反应、致病性感染以及诱发肿瘤等安全问题。在许多国家和地区，药物注册和监管机构对生物制药产品中的宿主细胞DNA残留有严格的要求和限制。通过检测和控制宿主细胞DNA残留，可以评估生物制品的免疫原性风险和安全性。另外用于微量样品高通量测序时，也需要确保相关的大肠杆菌重组表达的酶没有大肠杆菌DNA的污染。

• 本试剂盒能高效灵敏地检测E.coli宿主细胞的残留DNA，最低检测限可至飞克。根据《中华人民共和国药典》2020年版第三部规定，检测DNA残留量的方法包括DNA探针杂交法、荧光染色法和定量PCR法，并且规定以细胞基质生产的生物制剂DNA残留量不能超过100pg/剂，以细菌或真菌基质生产的疫苗DNA残留量不能超过10ng/剂。本试剂盒基于中华人民共和国药典(2020年版)中外源性DNA残留量测定法中的定量PCR法，采用探针法qPCR，检测下限为3fg/μL，检测范围为3fg/μL～300pg/μL。
  
• 本试剂盒特异性强，HeLa细胞和CHO细胞基因组DNA对E.coli DNA残留检测无干扰。本试剂盒只检测E.coli宿主细胞DNA，与其它物种DNA无交叉反应。
  
• 本试剂盒稳定性高，不同程度的碎片化DNA对E.coli DNA残留检测基本无干扰。利用不同量微球菌核酸酶将E.coli DNA Control碎片化至不同程度，然后使用本试剂盒进行qPCR检测。结果显示，超过200bp的DNA，基本都会被检测到，不影响检测效果；但如果碎片化程度过于严重，导致200bp以下的DNA居多，会使DNA残留量检测值偏小。
  
• 本试剂盒重复性好。重复12次检测3pg/μL、30fg/μL E.coli DNA的CT值见下表，CV值(变异系数)均小于5%。
  

  重复次数	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12	CV
  3pg/μL CT值	24.41	24.22	24.67	24.79	24.76	25.07	24.71	24.6	25.02	24.86	24.89	25.28	1.11%
  30fg/μL CT值	31.54	31.48	30.79	32.2	31.73	30.71	31.99	31.49	31.48	32.1	31.53	31.73	1.38%

• 本试剂盒可搭配宿主细胞残留DNA提取试剂盒(磁珠法)用于样品提取。使用E.coli DNA Control模拟样品的回收率测试结果见下表。
  

  回收前残留DNA浓度	回收前体积	回收后残留DNA浓度	回收后体积	回收率
  30fg/μL	100μL	32.55fg/μL	100μL	108.5%
  3fg/μL	100μL	3.08fg/μL	100μL	102.7%

  • 回收率和样品浓度、体积、样品种类及实验操作等的不同而存在差异，表中数据仅供参考。
    
  • 根据中华人民共和国药典(2020年版·三部)“外源性DNA残留测定法”中“第三法定量PCR”对于结果计算的要求，加标样品的回收率应在50%～150%之间。

本试剂盒如果用于常规的96孔板qPCR检测(建议反应体系为20μL)或384孔板qPCR检测(建议反应体系为10μL)，本制品小包装分别可以进行50次和100次检测，中包装分别可进行200次和400次检测。

本制品提供了Low ROX和High ROX，广泛兼容于无需ROX和需要Low ROX或High ROX作为校正染料的荧光定量PCR仪。ROX的作用是用于校正与PCR无关的荧光波动，从而最大限度减少孔间差异。这种差异可能由多种因素引起，如移液误差及样品蒸发等。不同的荧光定量PCR仪对ROX的要求不同，请根据实际所用仪器选择含高浓度ROX (High ROX)、低浓度ROX (Low ROX)或不含ROX的2×ByFast Probe qPCR Mix。通常含高浓度ROX的qPCR Mix也可以用于不需要ROX或需要低浓度ROX的荧光定量PCR仪。常用仪器所需ROX类型请参考如下表格。

• 本制品请在首次开启后建议立即使用完毕，或务必在无菌条件下对其适当分装并保存于-20℃，以免空气中的大肠杆菌污染影响实验结果。
  
• 使用前请务必确保试剂完全融化，充分混匀后使用。混匀过程尽量避免产生气泡。
  
• 10×Primer/Probe Mix、50×Low ROX、50×High ROX中含有荧光染料，保存本制品或设置PCR反应体系时应避免强光照射，以尽量避免荧光淬灭问题。
  
• 经测试，本制品反复冻融10次对使用效果无显著影响，但仍需尽量避免反复冻融。反复冻融可能使产品性能下降。
  
• qPCR检测是超高灵敏度的检测，请尽量在标准的PCR实验室中进行检测。PCR反应设置区域须尽量避免各种可能的扩增产物的污染。虽然本制品为防污染型，但仍建议勿在PCR反应设置区域撕开PCR封板膜或打开PCR管盖，PCR产物宜密封后按扩增后产物要求处理，以避免超高浓度的PCR产物污染实验环境。
  
• 建议使用带滤芯的吸头配制PCR体系，这样可以最大限度的避免污染导致的假阳性。
  
• 建议使用低吸附的1.5mL离心管，样品回收率高。推荐无核酸酶离心管(1.5mL)。

• 用于阳性对照检测的平均CT值、平均lgCT以及根据标准曲线计算所得的浓度见下表，扩增及标准曲线参考图1。
  

  Target	300pg/μL	30pg/μL	3pg/μL	300fg/μL	30fg/μL	3fg/μL	NTC
  平均CT值	18.99	21.95	25.28	29.08	31.9	35.2	Undetermined
  平均lgCT	2.37	1.47	0.45	-0.71	-1.57	-2.57	-
  浓度	236.5pg/μL	29.55pg/μL	2.85pg/μL	197.14fg/μL	27.18fg/μL	2.67fg/μL	-

  
  
  图1．本试剂盒用于不同浓度梯度的阳性对照的扩增曲线及标准曲线。将本试剂盒中的E.coli DNA Control稀释至浓度分别为300pg/μL、30pg/μL、3pg/μL、300fg/μL、30fg/μL和3fg/μL，然后用本试剂盒进行qPCR检测。NTC,No Template Control。实测数据可能会因样品、检测仪器等的不同而存在差异，图中数据仅供参考。
  
• 本试剂盒只检测E.coli宿主细胞DNA，与其它物种DNA无交叉反应。
  
  图2．本试剂盒检测不同浓度梯度阳性对照以及分别加入10倍量HeLa和CHO细胞基因组DNA的阳性对照的标准曲线。实测数据可能会因样品、检测仪器等的不同而存在差异，图中数据仅供参考。
  
• 本试剂盒检测不同碎片化程度DNA的扩增曲线及标准曲线参考图3，DNA碎片化处理的电泳结果参考图4。
  
  图3．本试剂盒对不同程度碎片化大肠杆菌DNA的检测效果图。E.coli基因组DNA经不同量MNase碎片化处理后稀释成如图1中的各个浓度进行检测。实验结果显示，在0.05和0.1 gel unit的MNase处理后，检测结果和未碎片化处理的对照(control)基本一致；在0.5 gel unit的MNase处理后，由于大部分DNA在200bp以下(见图4)，此时CT值明显增加。实测数据可能会因样品、检测仪器等的不同而存在差异，图中数据仅供参考。
  
  图4．不同量MNase碎片化处理的大肠杆菌基因组DNA的电泳图。E.coli DNA约0.5μg，37℃ 15分钟进行碎片化处理后终止反应。实测效果可能会因样品种类、检测仪器等的不同而存在差异，图中数据仅供参考。

• 需要用户自备的耗材、仪器和试剂：
  
  • 具有FAM荧光通道的荧光定量PCR仪。
    
  • DNase-free、RNase-free的吸头、低吸附离心管、荧光定量PCR用96孔板或384孔板、PCR板封板膜。
• 样品准备：
  选择合适的残留DNA样品制备试剂盒用于纯化提取生物制品的中间品、半成品和成品等中的大肠杆菌宿主细胞残留的基因组DNA，以此去除样品中抑制qPCR反应的物质。推荐使用磁珠法宿主细胞残留DNA提取试剂盒(货号：YTC0679)用于样品提取。
  
  • 由于本试剂盒灵敏度特别高，通常建议把样品制备的房间、qPCR反应体系配制的房间、处理扩增产物的房间按顺序分成3个房间，以避免出现假阳性。高浓度E.coli DNA Control处理时须特别小心，仅稀释后的E.coli DNA Control可以带入qPCR反应体系配制的房间。
• E.coli DNA Control标准曲线设置：
  用本试剂盒中提供的Dilution Buffer将E.coli DNA Control (30ng/μL)进行梯度稀释，按照下表依次配制300pg/μL、30pg/μL、3pg/μL、300fg/μL、30fg/μL、3fg/μL的E.coli DNA Control。
  

  管号	稀释方法	浓度
  ST0	10μL E.coli DNA Control (30ng/μL) + 90μL Dilution Buffer	3ng/μL
  ST1	10μL ST0 + 90μL Dilution Buffer	300pg/μL
  ST2	10μL ST1 + 90μL Dilution Buffer	30pg/μL
  ST3	10μL ST2 + 90μL Dilution Buffer	3pg/μL
  ST4	10μL ST3 + 90μL Dilution Buffer	300fg/μL
  ST5	10μL ST4 + 90μL Dilution Buffer	30fg/μL
  ST6	10μL ST5 + 90μL Dilution Buffer	3fg/μL

  • E.coli DNA Control (30ng/μL)和Dilution Buffer使用前置于冰上或4℃融化，Vortex充分混匀后使用。
  • 每次稀释时应注意充分混匀。
  • ST0管可置于-20℃保存，3个月有效；Dilution Buffer可置于4℃保存，至少一周有效，如果长时间不用，可以在-20℃保存。
• 样品加标回收质控ERC和阴性质控NEC的制备(选做)：
  根据实验需要，设置ERC (Extraction/Recovery Control)，即在待测样品中加入已知浓度的标准品，与待测样品同时进行DNA提取，并进行qPCR检测，以计算待测样品的回收率，进而评估样品回收的效率。设置NEC (Negative Extraction Control)，即仅含Dilution Buffer不含待测样品，与待测样品同时进行DNA提取，以评估检测系统本身、环境、人为等因素造成的误差及差异等。
  
  • ERC的制备：以制备加3pg E.coli DNA量的ERC为例，取90μL待测样品和10μL 300fg/μL (即3pg)的ST4加入1.5mL离心管中，充分混匀，标记为ERC。
    
  • NEC的制备：取100μL Dilution Buffer加入1.5mL离心管中，标记为NEC。
    
    • ERC、NEC与待测样品须同批进行提取处理(同步骤2)。若样品中E.coli DNA残留较高，需要稀释后再添加E.coli DNA标准品，加标量在样品量的0.1～10倍范围内比较合适。
• qPCR反应体系的设置：
  
  • 融解并混匀反应所需的各种溶液，置于冰浴上或冰盒内。
    
  • 参考下表在室温或冰浴上设置qPCR反应体系(以96孔板，每孔反应体系为20μL为例)。下表中的Template为样品(纯化提取的或稀释后的)、无模板阴性对照(No Template Control,NTC)、标准品(E.coli DNA Control)、ERC或NEC (可选)。NTC可使用Dilution Buffer。建议每次检测都设置NTC和Standard。
    

    成分	用量
    2×ByFast Probe qPCR Mix(含UDG)	10μL
    10×Primer/Probe Mix	2μL
    模板	2μL
    50×ROX	0或0.4μL
    超纯水	至20μL

  • 用移液器轻轻吹打混匀或轻微Vortex混匀，室温离心数秒，使液体积聚于管底。
    
  • 将设置好的PCR反应管或PCR反应板置于荧光定量PCR仪上，开始PCR反应。
    
  • 荧光检测通道的选择：E.coli DNA Probe的荧光基团是FAM，可选择检测通道为FAM，淬灭基团是BHQ1，如果没有BHQ1，则选择无。
• qPCR反应程序：
  本试剂盒建议采用如下的qPCR程序，本程序是以QuantStudio 6 Flex Systems荧光定量PCR仪为例：
  
  • UDG酶处理：50℃ 5min
    
  • 预变性：95℃ 2min
    
  • 变性：95℃ 15sec
    
  • 退火/延伸：60℃ 30sec
    
  • 重复步骤c和步骤d，总共40个循环
    
  • 最后使用荧光定量PCR仪提供的软件分析检测结果
• 结果的定性判断：
  
  • 无模板阴性对照(NTC)：FAM通道无典型扩增曲线，检测结果应为Undetermined或CT值≥38，或根据实验室自身验证结果设定具体标准；
    
  • 标准曲线：R2≥0.98，扩增效率(Efficiency,Eff) ＝ 90～110%；
    
  • NEC的CT值大于标准曲线最低浓度的CT值；
    
  • 样品浓度的计算：根据标准曲线有效范围内的CT值并结合标准曲线公式计算样品浓度(pg/μL或fg/μL)。请勿使用标准曲线有效范围之外的CT值计算待测样本的浓度；
    
  • 加样回收率的计算：根据待测样品和加标样品(ERC)的检测结果计算加样回收率，加样回收率要求在50～150%之间。计算示例如步骤7f。
    
  • 计算示例：
    ① 样品浓度计算示例：
    使用磁珠法宿主细胞残留DNA提取试剂盒(货号：YTC0679)对100μL模拟待测样品(含BSA)以及对应的加标样品(即在待测样品基础上再添加一定量的标准品)进行制备操作，并使用本试剂盒检测样品浓度：

    复孔	待测样品CT值	待测样品lgCT	待测样品浓度	加标样品CT值	加标样品lgCT	加标样品浓度
    1	33.53	0.97	9.36fg/μL	31.6	1.54	35.0fg/μL
    2	34.30	0.74	5.53fg/μL	31.84	1.47	29.7fg/μL
    3	33.82	0.89	7.68fg/μL	31.73	1.51	32.0fg/μL

    • 上表中用于计算样品浓度的标准曲线公式为：Y = -3.371X + 36.804，其中Y为CT值，X为该待测样品浓度的对数，斜率和Y轴截距是由荧光定量PCR仪自动生成。
    ② 加样回收率计算示例：
    根据步骤①中待测样品浓度及加标样品浓度，计算回收率：
    

    复孔	待测样品浓度	加标样品浓度	洗脱体积	加标量	回收率
    1	9.36fg/μL	35.0fg/μL	100μL	3000fg	85.4%
    2	5.53fg/μL	29.7fg/μL	100μL	3000fg	80.5%
    3	7.68fg/μL	32.0fg/μL	100μL	3000fg	81.1%

    • 上表中用于计算加样回收率的公式为：(加标样品的浓度-待测样品的浓度)×洗脱体积/加标量。